基準(zhǔn)醫(yī)療文章速遞：結(jié)直腸癌早期診斷cfDNA甲基化模型的探索

基準(zhǔn)醫(yī)療多癌種早篩系列報(bào)道-結(jié)直腸癌篇

2021-04-06 09:00 32350

基準(zhǔn)醫(yī)療（AnchorDx）與中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院的蘭平教授和吳現(xiàn)瑞教授團(tuán)隊(duì)在Molecular Oncology（影響因子: 6.574）發(fā)表了一篇題為“A novel cell-free DNA methylation-based model improves the early detection of colorectal cancer”的研究論文。

廣州2021年4月6日 /美通社/ -- 基準(zhǔn)醫(yī)療（AnchorDx）與中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院的蘭平教授和吳現(xiàn)瑞教授團(tuán)隊(duì)在Molecular Oncology（影響因子: 6.574）發(fā)表了一篇題為“A novel cell-free DNA methylation-based model improves the early detection of colorectal cancer”的研究論文。

基準(zhǔn)醫(yī)療已上市產(chǎn)品

結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大最常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管治療方法有所改善，但TNM晚期CRC患者的預(yù)后仍較差。I期CRC患者的5年生存率為91%，而IV期僅為14%。因此，對(duì)早期CRC的精準(zhǔn)篩查是降低CRC相關(guān)死亡率的關(guān)鍵策略之一。

目前，CRC篩查方法主要分為有創(chuàng)結(jié)腸鏡檢查和無(wú)創(chuàng)大便CRC篩查，有創(chuàng)結(jié)腸鏡檢查存在對(duì)技術(shù)和設(shè)備要求高、檢查前需要徹底清潔腸道、侵入性檢查會(huì)帶來(lái)一定的痛苦和并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)、患者依從性差等問(wèn)題；而無(wú)創(chuàng)大便CRC篩查存在假陽(yáng)性率高、非必要的治療、價(jià)格相對(duì)較高、缺乏長(zhǎng)期隨訪研究數(shù)據(jù)等問(wèn)題，現(xiàn)階段迫切需要一種高靈敏度和特異度的無(wú)創(chuàng)性CRC篩查產(chǎn)品。

本項(xiàng)目研究通過(guò)187個(gè)組織DNA樣本（91個(gè)非惡性組織，26個(gè)進(jìn)展期腺瘤[AA]和70個(gè)CRC）和489個(gè)血漿cfDNA樣本進(jìn)行靶向DNA甲基化測(cè)序，建立并驗(yàn)證了用于AA和早期CRC非侵入性檢測(cè)的基于11個(gè)DNA甲基化生物標(biāo)志物的cfDNA甲基化模型。

1、研究工作流程

為鑒定結(jié)直腸癌（CRC）特異的DNA甲基化生物標(biāo)志物，研究者收集了313個(gè)組織樣本（139例正常，30例進(jìn)展期腺瘤[AA]和144例結(jié)直腸癌[CRC]）進(jìn)行靶向DNA甲基化二代測(cè)序（NGS）。此外，為進(jìn)一步探索這些DNA甲基化標(biāo)志物在CRC早期檢測(cè)中的臨床應(yīng)用，采集了577例血漿樣本（169例健康對(duì)照組、44例非進(jìn)展期腺瘤[NAA]、76例AA和288例CRC）進(jìn)行NGS測(cè)序分析。經(jīng)過(guò)DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建和DNA甲基化測(cè)序的質(zhì)控，最終分析了187個(gè)組織樣本和489個(gè)血漿樣本。應(yīng)用Wilcoxon檢驗(yàn)和Benjamini-Hochberg多重檢驗(yàn)篩選組織隊(duì)列，得到了667個(gè)CRC特異的DNA甲基化生物標(biāo)志物。將133例正常血漿樣本和248例CRC血漿樣本隨機(jī)分組到訓(xùn)練和驗(yàn)證集中，進(jìn)行建模分析，從該667個(gè)生物標(biāo)志物中進(jìn)一步篩選CRC特異甲基化生物標(biāo)志物。在LASSO選擇后，基于訓(xùn)練集獲得11個(gè)CRC特異性甲基化生物標(biāo)志物，然后使用驗(yàn)證集進(jìn)一步確認(rèn)。最終，通過(guò)對(duì)NAA、AA和CRC患者的診斷來(lái)評(píng)估該模型的臨床價(jià)值。同時(shí)，通過(guò)與癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）方法的比較，評(píng)估了該模型在CRC管理中的穩(wěn)定性。（Figure 1）

Figure 1. The study workflow chart.

2、健康對(duì)照組、NAA、AA和CRC患者的cfDNA提取分析

比較551例（162例健康對(duì)照[正常]、44例非進(jìn)展期腺瘤[NAA]、74例進(jìn)展期腺瘤[AA]、69例結(jié)直腸癌I期[I]、97例結(jié)直腸癌II期[II]、70例結(jié)直腸癌III期[III]、35例結(jié)直腸癌IV期[IV]）cfDNA質(zhì)控合格的樣本的cfDNA濃度。數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）；ns，不顯著（Figure 2，***p<0.001；****p<0.0001）。

Figure 2. The cfDNA extraction analysis in healthy controls, NAA, AA, and CRC patients.

3、組織DNA甲基化圖譜的表征

187個(gè)組織樣本中667個(gè)結(jié)直腸癌（CRC）特異DNA甲基化生物標(biāo)志物的無(wú)監(jiān)督分層聚類分析（Figure 3A）。CRC、進(jìn)展期腺瘤（AA）和正常樣本的主成分分析（Figure 3B）。CRC與AA組甲基化模式的相關(guān)性分析（Figure 3C）。基于9921個(gè)生物標(biāo)志物計(jì)算平均甲基化水平。圖中的值是與正常樣本共甲基化值（PCM）的比值，然后進(jìn)行Log2轉(zhuǎn)換來(lái)生成的。

Figure 3. Characterization of the tissue DNA methylation landscape.

4、cfDNA甲基化模型檢測(cè)腺瘤和CRC患者的性能和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分

在訓(xùn)練和驗(yàn)證集中，模型的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.90（0.85-0.94）和0.92（0.88-0.96）（Figure 4A-B）。應(yīng)用于腺瘤患者的診斷時(shí)，該模型在腺瘤、非進(jìn)展期腺瘤（NAA）和進(jìn)展期腺瘤（AA）中分別達(dá)到0.82（0.76-0.87）、0.77（0.69-0.86）和0.85（0.78-0.91）（Figure 4C-E）。該模型在I期結(jié)直腸癌檢測(cè)中的AUC為0.90（0.86-0.95）（n=199）（Figure 4F）。該模型在結(jié)直腸癌（CRC）患者的診斷中表現(xiàn)突出，AUC為0.91（0.88-0.94）（n=381）（Figure 4G）。在CRC和AA隊(duì)列（n=449）的檢測(cè)中，模型的總體AUC為0.90（0.87-0.93）（Figure 4H）。模型在健康對(duì)照（正常）和NAA、AA以及結(jié)直腸癌I-IV期患者中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（n=489，配對(duì)t檢驗(yàn)；Figure 4I，*****p<0.0001）。

Figure 4. The performance and risk score of the cell-free DNA methylation model in detecting adenoma and CRC patients.

5、cfDNA甲基化模型與腫瘤生物標(biāo)志物CEA和CA19-9的CRC診斷性能比較

cfDNA甲基化模型、癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9）檢測(cè)結(jié)直腸癌（CRC）的ROC曲線下面積分別為0.91（0.88-0.94）、0.77（0.72-0.82）和0.59（0.53-0.65；Figure 5）。

Figure 5. Comparison of CRC diagnostic performance between the cfDNA methylation model and the tumor biomarker CEA and CA19-9.

本研究建立并驗(yàn)證了用于AA和早期CRC非侵入性檢測(cè)的基于11個(gè)DNA甲基化生物標(biāo)志物的cfDNA甲基化模型。我們收集了來(lái)自CRC、進(jìn)展期腺瘤（AA）、非進(jìn)展期腺瘤和健康對(duì)照組的313個(gè)組織和577個(gè)血漿樣本，去除質(zhì)控不合格的，選擇187個(gè)組織DNA樣本（來(lái)自CRC患者的91個(gè)非惡性組織，26個(gè)AA和70個(gè)CRC）和489個(gè)血漿cfDNA樣本進(jìn)行靶向DNA甲基化測(cè)序。在訓(xùn)練隊(duì)列中基于11個(gè)甲基化生物標(biāo)志物（ROC曲線下面積[AUC]=0.90[0.85-0.94]）開(kāi)發(fā)了一個(gè)用于CRC檢測(cè)的cfDNA甲基化模型，該模型在驗(yàn)證隊(duì)列（AUC=0.92[0.88-0.96]）中得到驗(yàn)證。本研究建立的cfDNA甲基化模型能夠穩(wěn)定地診斷出早期CRC（AUC=0.90[0.86-0.95]）或AA（AUC=0.85[0.78-0.91]）的患者。該模型將在CRC的早期診斷臨床實(shí)踐中發(fā)揮著積極作用。